基因组注释（6）——在线版eggNOG-mapper注释功能基因

基因功能注释的原理都是相似的，我们拿到了蛋白序列之后，与现有的蛋白数据库进行比对，统计比对结果。稍微介绍几个常用的比对数据库，其他没介绍到的可以参考本站网址导航—生信网站快速导航，里面有本人年初总结的一些常用生信数据库和工具（有好的工具也可以联系我补充）。

1.1 NR数据库

NR数据库全称Non-Redundant Protein Sequence Database（非冗余蛋白数据库），由NCBI建立和维护，可以在NCBI主页的Data&Software入口找到FTP：BLAST Databases。用过本地blast的人都知道，blast比对NR/NT库的结果中包含了物种注释信息和相应的氨基酸序列，可以用于物种分类、数据污染评估等等（没用过的话可以参考我的这篇博客——数据污染评估）。

一般的注释方法和数据污染评估一样，使用blastp的比对方法，设置-evalue 1e-5, -max_target_seqs 1，只保留匹配得分最高的蛋白序列。

1.2 KEGG数据库

KEGG数据库全称Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，是日本京都大学生物信息学中心1995年建立的数据库，该数据库描述生物体中复杂的生物学通路，其丰富的通路信息帮助我们系统了解蛋白的生物学功能，如代谢通路、遗传信息传递以及细胞过程等一些复杂的生物功能。

一般的注释方法同上，比对的数据库为KEGG数据库，并统计蛋白序列注释到的KEGG通路信息。

1.3 KOG数据库

KOG数据库全称Eukaryotic Orthologous Groups of protein（真核同源群数据库），和这个数据库齐名的还有COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins），这两个数据库都是NCBI中基于直系同源关系的数据库，COG针对原核生物，KOG针对真核生物。其比对原理是将蛋白序列比对并注释到某个同源蛋白簇中，这个同源蛋白簇是NCBI通过生物的完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成的，比对到的同源蛋白簇揭示该蛋白的功能。

一般的注释方法同上，比对的是KOG数据库，并统计蛋白序列注释的KOG信息。

1.4 GO数据库

GO数据库全称Gene Ontology，数据库由基因本体联合会建立，是将所有与基因有关的研究结果进行分类汇总的综合数据库。可能听起来比较抽象，基因本体论的本质是用特定的一套词汇描述生物学功能，对不同物种的基因功能进行注释的统一化（去掉物种特异性），我们可以将基因按照其参与的生物过程（BiologicalProcess， BP） 、 细胞组分（Cellular Component， CC） ， 分子功能（Molecular Function， MF） 三个方面进行分类注释。很多蛋白数据库都带有GO号注释信息。

GO注释目前有两种主要的注释方法：

1. 序列相似性比对，也就是上面blast方法，比对的数据库可以是Swissport，提取GO列的注释信息。
2. 结构域相似性比对，常用的软件有InterproScan ，比对的数据库可以是Pfam数据库（一个蛋白质域家族的数据库），也是提取GO注释信息。

1.5 Swissprot数据库

Swissprot（不要打成Swissport，瑞士机场）隶属于Uniprot数据库， 包含经过注释和验证的严格非冗余的蛋白序列数据库， 提供了蛋白序列详尽的注释信息。也是一个非常常用的蛋白注释数据库，现在UniprotKB（Universal Protein Knowledge Base）主要由两个子库构成，一个是TrEMB（该部分是计算机进行分析注释的，未人工校验的蛋白），另一个就是Swissprot。

一般的注释方法同上，比对Swissprot数据库，统计基因组蛋白序列注释到的Swissprot数据库蛋白信息。

上面介绍的是一般情况下我们做基因功能注释要用的数据库，全都是可以用blast比对相应的数据库，最后做个汇总比如韦恩图查看各个数据库注释的情况。

之所以说一般情况，是因为随着算法和技术的发展，不断有新的比对工具（比如DIAMOND，速度是blast的100到10000倍；还有基于隐马尔科夫模型的HMMER 3等）和注释流程的出现，这些经典的方法固然可用，缺点也很明显：比对速度慢，需要下载大量的比对数据库，占用资源等等。

eggNOG（evolutionary gene genealogy Non-supervised Orthologous Groups）数据库是从NCBI的COG/KOG延伸出来的，前面介绍过这两个数据库是直系同源数据库，在2008年提出的eggNOG的时候只有这两个直系同源数据库，这两个数据库在当时一方面是数据不多（当时只有 312 个细菌、26 个古细菌和 35 个真核生物基因组），另一方面是更新缓慢，主要对当时比较基因组学研究影响较大。

看到Non-supervised无监督这几个字，相信有的小伙伴就明白了，他们用了Smith–Waterman算法（与blast齐名的寻找序列最优相似比较的算法，比blast更精准）构建了直系同源群（Orthologous Group），并且通过基因的描述文件、注释的功能类别和预测的蛋白质结构域等，自动注释这些直系同源群。这种非监督的方法，不受物种限制，不限于已有基因的功能和关系，这种灵活性、可扩展性和跨物种比较的优势，可以帮助人们发现新的功能和关系，并提供基于进化关系的功能注释。

感兴趣的可以看看下面这篇2008年的原文：

eggNOG: automated construction and annotation of orthologous groups of genes - PMC (nih.gov)

经过十几年的迭代，eggNOG现在已经发布了6.0版本（2023年1月6日），总的来说，eggNOG 6.0提供了超过1700万个直系同源群 (OG) ，涵盖10756个细菌、457个古细菌和1322个真核生物，这些直系同源群可注释的信息包括 KEGG、GO、UniProtKB、BiGG、CAZy、CARD、PFAM 和 SMART。此外，eggNOG 6.0网站还推出了挖掘直系同源基因和基因功能数据分析的新功能，包括为跨物种的多个直系同源群生成系统发育图谱等。

eggNOG-mapper是eggNOG推出的一款进行批量基因功能注释的工具，在2021年的时候已经更新到了v2版本，主要更新了从raw contigs开始的从头基因预测、内置成对的同源预测（built-in pairwise orthology prediction）、快速检测蛋白结构域和自动生成gff文件四项功能。

3.1 eggNOG-mapper原理

整个流程和原理可以用作者原文的一张图概括：

A: 编码基因预测阶段，用Prodigal从组装的contigs中进行蛋白预测（或者blastx模式预测）。

B: 搜索阶段，选择HMMER或者DIAMOND或者MMESQS2将输入的蛋白序列和EggNOG数据库进行比对，生成seed orthologs。

C: 直系同源推断阶段，根据所需要的分类范围，生成直系同源报告。

D: 注释阶段，根据蛋白注释信息和蛋白结构域注释信息，生成表格和gff格式的报告。

3.2 运行网页版eggNOG-mapper

eggNOG-mapper这个工具可以下载到本地运行（主要是方便宏基因组这种大批量的注释），也可以在线运行，官方提供了在线服务地址http://eggnog-mapper.embl.de

因为我自己不是做宏基因组的，所以也没必要下载工具和数据库（需要的时候再更），直接使用在线服务就可以。

可以看到eggNOG-mapper在线版支持5种类型数据输入：

Proteins：蛋白序列，上限是10万条序列

CDS：CDS序列，上限也是10万条，会在搜索前倍翻译成蛋白序列

Genomic：基因组序列，支持最多1000条DNA序列，1000万个核苷酸。直接上传基因组序列会多一步编码蛋白预测，可以选择使用Prodigal或者Blastx-like这两者之一。

Metagenomic：Contig级别的基因组序列，本质上和上面是一样的，所以限制条件也相同。同样会进行编码蛋白预测。

Seeds：eggNOG-mapper跑的seed orthologs，支持最多上传10万条，这个主要用于重新注释。

我们前面拿到了蛋白序列，所以直接上传蛋白序列即可，注意一下上传的要求是.gz的压缩文件。所以稍微处理下：

1
2

# 保留原文件，以gz格式压缩为另一个文件
gzip -c Ap_rmTE.aa > Ap_pep.gz

上传gz文件，留下邮箱，底下还可以设置比对的参数和注释的参数，都以默认参数运行即可。稍微说下注释的一些参数：

Taxonomic Scope：可以手动选择的分类范围，官方建议是默认的方式，但也可以手动选择，比如我注释植物，就可以选择Viridiplantae绿色植物。这里的参数会影响流程里的直系同源推断阶段的范围，默认情况下每个序列都会自动调整。

Orthology restrictions：直系同源限制，可以选择from any ortholog或者from one to one ortholog，也是影响直系同源推断阶段的结果，后者只会在直系同源中匹配。

Gene Ontology evidence：基因本体论证据，这里是两种：1. experimental，也就是有实验支撑的（比如做过亚细胞定位啊，免疫荧光啊这些）。2. non-electronic，通俗说就是“非电子”证据，电子证据是与实验证据相距最远的，这里的指的是除实验和电子以外的证据。

PFAM refinement：这里的选项是对蛋白结构域注释的调整，可以直接出报告，也可以再将序列进行realign等。

SMART annotation：顾名思义，就是这步可以用SMART再进行蛋白质结构域预测，默认是跳过的。

关于基因本体论的证据，GO官网有解释，我这里解释可能不是很清楚，可以查看官网对基因本体论的证据说明以及分类：

Guide to GO evidence codes (geneontology.org)

所有参数确定之后，点击submit，网页会提醒你查看邮件。进入邮箱，点击第一个第一个选项Click to manage your job，再点击Start job即可开始运行。

3.3 eggNOG-mapper结果文件解读

在线运行还是非常快的~我这20000个左右的蛋白序列，吃个饭的功夫回来就跑完了，不用下数据库不用配置环境就可以做分析，一个字，香！

当我们看到右上角状态为Done后，就证明已经跑完了。我们返回前一个页面，点击Access your job files here，这个链接就是我们结果文件的存储位置，注意存储是暂时的，需要我们尽快下载到本地保存。

检查日志无报错即可。我们主要用的是其中的两个annotations文件，一个是方便你自己提取内容做富集分析（内容制表符分割，怎么提取和做GO、KEGG富集分析下次再说吧，写个脚本的事），第二个带.xlsx后缀方便你用excel编辑和打开。

这里主要讲一下结果文件的各项参数代表什么意思：

• 1. query：蛋白序列名称
• 2. seed_ortholog：搜索阶段比对上的seed ortholog编号
• 3. evalue：evalue值，越小结果越可靠
• 4. score：比对的得分，越大越可靠
• 5. eggNOG_OGs：为序列确定的以逗号分隔、按照进化分支深度排序的直系同源组（orthologs groups，OGs）列表。每个直系同源组以OG@tax_id|tax_name方式展现。
• 6. max_annot_lvl：用于检索注释的最宽的直系同源组，以tax_id|tax_name方式展现。
• 7. COG_category：从最佳OG中推测的COG功能分类（一个字母），具体有哪些可以看这里NCBI的介绍COG - NCBI (nih.gov)。
• 8. Description：注释的基因功能描述（eggNOG-mapper注释的描述真的很简短……）
• 9. Preferred_name：普遍使用的基因名缩写
• 10. GOs：注释的GO编号，一个基因可能对映非常多的GO号
• 11. EC：KEGG的EC通路编号，代表相关的酶
• 12. KEGG_ko：KEGG的KO编号，表示直系同源基因，代表一个具体的功能
• 13. KEGG_Pathway：通常有ko编号和map编号，map编号代表reference pathway，是一种代谢通路类型，比较具体有一般参考意义
• 14. KEGG_Module：KEGG Module数据库编号，以M开头，实际上就是多个KO划分在一个共同发挥功能的单元里
• 15. KEGG_Reaction：KEGG Reaction数据库编号，以R开头，包含代谢通路上酶促反应相关信息
• 16. KEGG_rclass：KEGG RCLASS数据库编号，以RC编号开头，手动整理的反应数据集合
• 17. BRITE：KEGG的Brite数据库编号，用的不是很多，是一个储存分类信息的数据库
• 18. CAZy：碳水化合物酶相关的专业数据库，可以看官网CAZy - Home
• 19. BiGG_Reaction：BiGG是一个整合基因组尺度代谢网络模型的数据库，官网BiGG Models (ucsd.edu)
• 20. PFAMs：PFAM数据库，根据多序列比对结果和隐马尔可夫模型，将蛋白分为不同家族的一个数据库，官网InterPro (ebi.ac.uk)。没错官网是InterPro，pfam数据库已经被InterPro合并，并且2023年1月之后原网页就失效了。

这么多数据咋一看很头疼，可以整理一下写个脚本，做GO和KEGG富集分析，这个下次再说。